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    • 专利摘要:
    本發明揭露一種在早期階段檢測肝癌及預測肝癌轉移之方法，其步驟包括：(A)提供待測者之生物樣本；(B)檢測生物樣本之α-甘露糖苷酶四亞型表現量；(C)將生物樣本之α-甘露糖苷酶四亞型表現量與正常控制組樣本之α-甘露糖苷酶四亞型表現量作比較；(D)根據結果判定待測者之風險：其中待測樣本之MAN1C1表現量低於與正常控制組之MAN1C1表現量時，判定待測者具有罹患肝癌之風險；另外，待測樣本之MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1表現量高於與正常控制組之表現量時，判定待測者已罹患肝癌且具轉移之風險。未來可將MAN1C1應用於早期檢測肝癌、抑制肝癌細胞轉移，以及篩選肝癌治療藥物等方面。
    公开号:TW201305560A
    申请号:TW100126558
    申请日:2011-07-27
    公开日:2013-02-01
    发明作者:Horng-Dar Wang；Chiou-Hwa Yuh；Yung-Chun Hsiao；Yu-Ting Chou
    申请人:Nat Univ Tsing Hua；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    早期階段檢測肝癌及預測肝癌轉移之方法
    本發明係關於一種檢測肝癌及肝癌轉移的方法，特別是關於一種利用MAN1C1作為早期檢測肝癌、抑制肝癌細胞轉移，以及篩選肝癌治療藥物等方面。
    肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，台灣每年有近七千多人死於肝癌，肝癌的症狀在早期很不明顯，甚至患者在患病後較長時間毫無感覺，待病情發展到一定程度才會逐步產生一些肝區疼痛、食欲下降、疲乏無力、日漸消瘦等症狀，到晚期則會有黃疸、腹水、嘔血、昏迷等表現。肝癌病人的上腹部常可摸到巨大的腫塊，但此時已到中晚期，甚至已向肺部等處轉移。肝癌總的病程大約2年半時間，其中2年時間都是在沒有症狀的早期階段，一旦出現症狀就只有半年的存活時間。肝癌是一種非常難診斷的癌症，這種癌症也是導致亞洲和非洲人死亡的一個重要原因。而且，近年來肝癌發病率在西方國家中也呈逐年上升趨勢。對肝癌患者來說，移植往往是僅有的希望。而能夠在早期階段檢測診斷肝癌的方法將可能拯救無數人的生命。目前的一些檢測腫瘤生長的方法常常是根據血液中存在的特定標誌物的濃度來做出判斷。對於肝癌的檢測，通常只利用一種標誌物AFP。α胎兒蛋白常用英文縮寫AFP表示，它是懷孕初期胎兒血液中的一種血清蛋白，健康成人和兒童血液內測不到，但在95%原發性肝癌患者的血液中可發現，故常被用來當做肝臟腫瘤及肝硬化、肝炎等疾病的標記。這種標誌物的特異性低，常常出現假陽性結果。在肝癌的早期診斷預估台灣一年約有60億台幣潛在市場，而在國外市場將有更大的潛在市場。
    N-糖基化是機體蛋白質轉譯後的一種重要的修飾過程。參與蛋白質N-糖基化生物過程的許多酶主要位於胞漿內質網和高爾基體。甘露糖苷酶是一種參與糖蛋白合成和代謝的重要蛋白酶，它的功能是修剪N-聚糖中的甘露糖，在人類的甘露糖苷酶具有許多不同的分類。先前文獻已揭露某些類型的甘露糖苷酶與特定癌症的形成具有關聯性，顯示在某些特定癌症中，α-甘露糖苷酶具高表現，然而並未發現可運用於肝癌的早期檢測方面。而且發現α-Mannosidase II抑制劑-swainsonine[SW]處理注射血癌細胞[MDAY-D2]的裸鼠可以有效抑制腫瘤生長(Goss,1995)，而α-1,2 Mannosidase I抑制劑-1-Deoxymannojirimyci[DMJ]在細胞實驗上已經證實可以抑制膀胱癌細胞[T24]遷移能力(Przybylo,2005)，並會誘導肝癌細胞[7721]走向細胞凋亡路徑(Lu,2006)。根據這些報告文獻，本發明進一步探討四種α-甘露糖苷酶的基因表現量與肝癌不同時期之關聯性，及其表現與細胞遷移能力之關係。
    然而，雖然已知α-甘露糖苷酶的高表現與特定癌症具有關聯性，且抑制α-甘露糖苷酶的活性可抑制癌細胞生長、誘導癌細胞走向細胞凋亡路徑、甚至抑制癌細胞遷移能力。然而並未發現MAN1C1可運用於肝癌的早期檢測方面的應用，且未區分α-甘露糖苷酶四亞型之於肝癌的不同時期之表現。
    緣此，本發明之一目的即是提供一種利用MAN1C1之低表現作為早期檢測肝癌之方法。
    本發明也提供一種利用MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1高表現判定罹患肝癌且具轉移風險之方法。
    本發明之另一目的即是提供一種利用表現MAN1C1於肝癌細胞抑制肝癌細胞轉移的方法。
    本發明之又一目的即是提供一種篩選肝癌治療標靶藥物之生物標誌物。
    在一實施例中，本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係為一種早期檢測肝癌及預測肝癌轉移之方法，其步驟包括：(A)提供一待測者之生物樣本；(B)檢測該生物樣本之α-甘露糖苷酶四亞型(MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1及MAN1C1)表現量；(C)將該生物樣本之α-甘露糖苷酶四亞型表現量與正常控制組樣本之α-甘露糖苷酶四亞型表現量作比較；(D)根據比較結果判定該待測者是否具有罹患肝癌之風險：其中該待測樣本之MAN1C1表現量低於與該正常控制組之MAN1C1表現量時，判定該待測者具有罹患肝癌之風險；另外，若該待測樣本之MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1表現量高於與該正常控制組之此三個基因之表現量時，判定該待測者已罹患肝癌且具轉移之風險。
    較佳地，其中該待測樣本之MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1及MAN1C1表現量與該正常控制組之此四基因的表現量至少2倍以上的差異；且在步驟(D)更包括同時將該生物樣本之MMP9表現量與一正常控制組樣本之MMP9表現量作比較，若該待測樣本之MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1表現量高於與該正常控制組之此三個基因之表現量時，且該生物樣本之MMP9表現量高於該正常控制組樣本之MMP9表現量，判定該待測者肝癌具轉移之風險。上述α-甘露糖苷酶四亞型(MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1及MAN1C1)或MMP9表現量可以是RNA或蛋白質表現量，且待測者係患有B型肝炎，該生物樣本係為該待測者之肝臟細胞。
    在另一實施例中，可發展作為一種抑制肝癌細胞轉移的方法，包括在一肝癌細胞中過度表現MAN1C1，以抑制該肝癌細胞之轉移。較佳地，過度表現MAN1C1亦可降低該肝癌細胞中MMP9表現量。
    在又一實施例中，亦可發展作為一種篩選肝癌治療藥物之方法，包括：(A)提供一藥物處理過後之肝癌細胞；(B)檢測該肝癌細胞中MAN1C1表現量；(C)依據其MAN1C1表現量判定該藥物是否有效。較佳地，前述方法更包括檢測該肝癌細胞中MMP9表現量，並根據其MMP9表現量判定該藥物是否有效。
    經由本發明所採用之技術手段，可將MAN1C1應用於早期檢測肝癌及肝癌轉移、抑制肝癌細胞轉移，以及篩選肝癌治療藥物等方面。
    本發明之早期檢測肝癌及肝癌轉移之方法將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
    首先參閱第1圖，其顯示出高爾基體N-linked糖化作用路徑。如圖所示，α-甘露糖苷酶(α-1,2 Mannosidase I)在醣類代謝路徑上扮演切除糖基分支鏈的角色。其抑制劑包含DMJ及SW可抑制寡糖鏈的合成。寡糖鏈的合成和後加工過程包括了一系列糖苷水解酶的作用，如酶葡萄糖苷水解酶(水解寡糖鏈前體最外側的葡萄糖基)，葡萄糖苷水解酶Ⅱ(水解內部的葡萄糖基)，甘露糖苷水解酶，甘露糖苷水解酶Ⅰ、Ⅱ等。α-甘露糖苷酶I和II主要存在高爾基體中，α-甘露糖苷酶抑制劑可以終止N-糖鏈的進一步加工成複合型糖鏈，結果得到的糖鏈為高甘露糖型或雜合型的糖鏈結構。α-甘露糖苷酶I抑制劑-DMJ，α-甘露糖苷酶II的特異性抑製劑-SW，能改變細胞表面的醣類抗原決定部位的表達，進而影響到腫瘤的轉移和入侵，以及在體外的生長，表現出抑制腫瘤轉移的能力。
    第2A-2B圖係為本發明之實驗流程圖。參閱第2(A)圖，首先利用定量聚合酶反應方式檢測內生性的α-甘露糖苷酶(α-1,2 Mannosidase)在老鼠及人類肝癌患者mRNA的量。參閱第2(B)圖，選殖α-甘露糖苷酶基因MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1和MAN1C1。針對α-1,2 Mannosidase以大量表現和shRNA抑制其表現的方式進行體外細胞遷移試驗。並建立穩定表現MAN1C1細胞株打入斑馬魚胚胎進行活體異體移植進行體內細胞遷移試驗，同時以定量聚合酶反應方式檢測MMP9的mRNA的量是否因大量表現α-1,2 Mannosidase而改變而達到細胞遷移效果。
    參閱第3圖，其顯示在人類帶有B型肝炎病毒的肝癌患者的肝癌組織中MANA1、MANA2，MANB1、MAN1C及MAN1C1表現量。利用Q-PCR定量帶有HBV病人的MAN1A1、MAN1A2、MAN1B1和MAN1C1的mRNA表現量，其中MAN1C為部分MAN1C1。HBV病人分成三個時期：第一期，第二期和第三期，越後面表示癌症越嚴重。以同一位病人肝癌組織為實驗組，正常肝組織為對照組，肝癌組織比正常肝組織之表現比率若超過2倍則定義為過度表現；肝癌組織比正常肝組織之表現比率若小於0.5倍則定義為降低表現。如圖所示，MAN1A1、MAN1A2和MAN1B1的表現量隨著肝癌惡化程度而增加，並比正常肝組織增加2倍以上；但MAN1C1在早期肝癌病人肝癌組織表現量低於正常肝組織表現量2倍以上。
    參閱第4圖，利用定量聚合酶反應方式檢測不同細胞株中(A)內生性的MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1 mRNA的量(D)內生性的MAN1C1 mRNA的量(B)利用PLC5和(C)Hep3B進行體外細胞遷移試驗來決定用何種細胞株進行大量表現或shRNA抑制其表現的實驗。實驗方法主要是利用Q-PCR定量PLC5,Hep3B和HepG2的MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1和MAN1C1的mRNA表現量。連續稀釋(10-3~10-9)以已知分子數的綠螢光蛋白基因的DNA作為標準曲線。利用標準曲線，以內插法將Ct值換算成分子數，因而得到PLC5，Hep3B和HepG2細胞中的MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1和MAN1C1的內生性的分子數量。(B)(C)細胞移動能力試驗(Migration assay)。將105個細胞溶於300μl不含血清的培養基(serum free DMEM)置於transwell細胞培養盤上，盤上有一濾膜，該濾膜直徑為6.4 mm，孔徑為8.0 μm，下層加入500μl含10%小牛胚胎血清的培養基(10%FBS in DMEM)，放入37℃細胞培養箱中48小時後用1X DAPI染色拍照並計算transwell濾膜下層的細胞數。結果如圖所示，不同的細胞株中α-1,2 Mannosidase內生性的mRNA的量也不同，而體外細胞遷移試驗發現Hep3B的細胞遷移能力勝過PLC5。(E)根據內生性的mRNA的量和體外細胞移動能力試驗的結果決定利用PLC5作大量表現MAN1A1的實驗；在Hep3B中進行shRNA抑制MAN1A1,MAN1A2、MAN1B1表現的實驗，而MAN1C1則在Hep3B中進行大量表現的實驗。
    參閱第5A-5E圖，針對MAN1A1和MAN1C1利用大量表現後兩天，接著作體外細胞遷移試驗。(A)用Q-PCR定量MAN1A1和MAN1C1 mRNA表現量，並以沒有轉染的細胞(mock)為對照組。(B)(C)(D)(E)為細胞移動能力試驗，方法和第4B、4C圖一樣。(A)由結果發現：成功過度表現MAN1A1和MAN1C1的mRNA的量，分別上升到Hep3B的11.73倍和160278倍；同時細胞遷移能力也有改變，大量表現MAN1A1細胞遷移能力上升為原來的2.41倍；而MAN1C1大量表現則降低到原來的0.48倍。(B)(C)分別為PLC5細胞(B)、及大量表現MAN1A1在PLC5細胞(PLC5/MAN1A1)細胞遷移試驗結果圖片。(D)(E)分別為Hep3B細胞、及大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(Hep3B/MAN1C1)細胞遷移試驗結果圖片。
    參閱第6A-6E圖，針對MAN1A1,MAN1A2和MAN1B1利用shRNA抑制其表現後兩天，接著作體外細胞遷移試驗。實驗方法：(A)用Q-PCR定量MAN1A1，MAN1A2和MAN1B1 mRNA表現量，並以沒有轉染的細胞(mock)為對照組。(B)(C)(D)(E)為細胞移動能力試驗，方法和圖4(B)(C)一樣。(A)由結果發現：shRNA成功降低MAN1A1,MAN1A2和MAN1B1的mRNA的量，分別降低到原來的Hep3B細胞的55%,62%和64%；同時細胞遷移能力也下降，MAN1A1,MAN1A2和MAN1B1分別原來的Hep3B細胞的31%,38%和35%。(B)(C)(D)(E)分別為Hep3B、shRNA1A1、shRNA1A2和shRNA1B1抑制其表現細胞株體外細胞遷移試驗結果圖片。
    參閱第7A-7C圖，(A)利用穩定大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(MAN1C1/Hep3B)進行體外細胞遷移試驗。以穩定大量表現MAN1C1的Hep3B細胞作為實驗組，原來的Hep3B作為對照組進行體外細胞遷移試驗。實驗方法：(A)用Q-PCR定量MAN1C1 mRNA表現量，並以沒有轉染的細胞(mock)為對照組。(B)(C)為體外細胞遷移試驗，方法和圖4(B)(C)一樣，但分析的時間為二十四小時後。從圖中結果發現：大量表現MAN1C1細胞遷移能力降低為原來的Hep3B的16%。(B)(C)分別為Hep3B和大量表現MAN1C1在Hep3B細胞的體外細胞遷移試驗結果圖片。
    參閱第8A-8E圖，藉由活體異體移植進行體內細胞遷移試驗，測試293T,PLC5和Hep3B在活體中的細胞遷移能力，293T為人類腎臟細胞，PLC5和Hep3B為人類肝癌細胞。實驗方法：圖8.(A)斑馬魚異體移植試驗。先用紅色螢光染劑(DiI)將細胞標記紅色螢光，注射前先將細胞放置在PBS緩衝鹽液中，以顯微注射入受精後二天的斑馬魚胚胎體內。每次注射體積為4.6nl，注射細胞數大約400個細胞，注射位置在斑馬魚胚胎的卵黃後方處，如(D)所示。注射後連續觀察三天細胞在活體中的情況。在先前體外實驗結果中發現Hep3B的細胞遷移能力勝過PLC5，利用活體中方式再次驗證，(A)其中293T為非癌細胞對照組。統計分析後發現：293T和PLC5在注射後三天有6%小魚有細胞遷移現象，而Hep3B在注射後三天，高達62%小魚有細胞遷移現象，所以得到和先前體外實驗一致的結果。(B)顯微注射293T細胞3天後細胞仍停留在卵黃腔內。(C)顯微注射PLC5細胞3天後細胞仍停留在卵黃腔內(D)顯微注射Hep3B細胞魚卵黃腔的位置圖。(E)顯微注射Hep3B細胞後1天可發現細胞移動到斑馬魚尾部。
    參閱第9A-9D圖，(A)利用穩定大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(MAN1C1/Hep3B)進行活體異體移植細胞遷移試驗，以穩定大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(MAN1C1/Hep3B)作為實驗組，而Hep3B細胞作為對照組。利用顯微注射將實驗組與對照組細胞顯微注射入斑馬魚卵黃中，每次注射400個染色之細胞，在注射完畢後每隔二十四小時觀察並記錄。方法和第8圖一樣，但是實驗組細胞為穩定大量表現MAN1C1之Hep3B細胞；對照組細胞為只含穩定大量表現之載體。統計分析後發現：在注射3天時實驗組細胞遷移能力為18.6%；對照組為36.2%。由實驗結果得到：在注射3天時穩定大量表現MAN1C1的細胞遷移能力降低為原有的Hep3B的2倍左右。(B)在顯微注射對照組(原有的Hep3B細胞)注射1天斑馬魚胚胎中可以觀察到細胞遷移到尾巴處，(C)在注射3天時也有觀察到此現象；(D)而實驗組穩定大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(MAN1C1/Hep3B)有80%的斑馬魚胚胎在注射3天時仍停留在卵黃腔中。
    參閱第10圖，顯示出細胞生長試驗(MTT assay)之結果，X軸為時間(小時)，Y軸為細胞增生倍率。實驗方法：1.將6000顆細胞種入96孔盤中的小盤中。2.每隔24hr在每一個小盤加入200μl的細胞生長試驗混合培養基(MTT:DMEM=1；9)，在攝氏三十七度培養箱培養三小時。3.加入100μl二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide)或DMSO打破細胞，在波長OD570nm下測吸光值。實驗組：大量表現MAN1A1在Hep3B細胞；對照組：沒有轉染之Hep3B細胞。(A)細胞生長試驗發現：大量表現MAN1A1使Hep3B細胞生長速度比沒有轉染之Hep3B細胞之對照組快。(B)穩定大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(MAN1C1/Hep3B)大量表現MAN1C1的細胞生長曲線和對照組Hep3B細胞並無太大差異。
    參閱第11A-11B圖，(A)利用定量聚合酶反應方式檢測MMP9表現量，以沒有轉染之細胞為對照組。超過2倍為過度表現；小於0.5倍為降低表現。結果顯示MAN1A1過度表現使得MMP9表現量增加為對照組的2.3倍；在MAN1C1過度表現的情況下使MMP9表現量下降到對照組的0.33倍。(B)利用RT-PCR增幅MAN1C1和MMP9 cDNA，以18s當作加入控制組。從穩定大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(MAN1C1/Hep3B)中發現MMP9的表現量降低於對照組Hep3B細胞。
    本發明結果顯示，帶有B型肝炎病毒肝癌患者中肝癌組織的MAN1A1、MAN1A2、MAN1B1表現量比正常肝組織增加2倍以上；但94%的第一期B型肝炎病毒肝癌患者中肝癌組織MAN1C1表現則是比正常肝組織低2倍以上。於是針對人類中的四個α-1,2 Mannosidase I[MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1 and MAN1C1]進行大量表現和shRNA抑制其表現的方式去看是否影響肝癌細胞[Hep3B,PLC5]遷移能力。發現過度表現MAN1A1的肝癌細胞遷移能力上升，而過度表現MAN1C1會使細胞遷移能力下降；利用shRNA抑制MAN1A1,MAN1A2和MAN1B1表現則會使肝癌細胞遷移能力下降。為了更進一步確定α-1,2 Mannosidase I對細胞遷移能力的影響，建立穩定表現α-1,2 Mannosidase I肝癌細胞株，利用斑馬魚胚胎進行活體異種轉植實驗[in vivo xenotransplantation]來觀測肝癌細胞在活體移動情形；發現MAN1C1/Hep3B的穩定細胞株在斑馬魚胚胎中移動能力比起對照組下降。另外定量聚合酶反應方式檢測發現，當MAN1A1大量表現時會使MMP9 mRNA表現量增加；而MAN1C1大量表現則MMP9表現量下降(由於MMPs是具有分解細胞外基質的能力，降低MMP9的表現意味著細胞移動及侵犯的能力降低)。本發明之結果顯示出肝癌病人肝癌組織中MAN1C1早期表現量下降，具有作為早期肝癌檢測分子標誌之潛力。從細胞遷移實驗中也證實，不管是體外細胞遷移試驗或活體異體移植進行體內細胞遷移試驗的結果都證明MAN1C1可以抑制肝癌細胞的細胞遷移能力。
    綜合以上結果，MAN1C1極具有生物潛力可能為抑癌基因，未來可應用作為一種早期檢測肝癌之方法。在一實施例中，揭露一種早期檢測肝癌及肝癌轉移之方法，其步驟包括：(A)提供一待測者之生物樣本；(B)檢測該生物樣本之α-甘露糖苷酶四亞型(MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1及MAN1C1)表現量；(C)將該生物樣本之α-甘露糖苷酶四亞型表現量與正常控制組樣本之α-甘露糖苷酶四亞型表現量作比較；(D)根據比較結果判定該待測者是否具有罹患肝癌之風險：其中該待測樣本之MAN1C1表現量低於與該正常控制組之MAN1C1表現量時，判定該待測者具有罹患肝癌之風險；另外，若該待測樣本之MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1表現量高於與該正常控制組之此三個基因之表現量時，判定該待測者已罹患肝癌且具轉移之風險。
    較佳地，其中該待測樣本之MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1及MAN1C1表現量與該正常控制組之此四基因的表現量至少2倍以上的差異；且在步驟(D)更包括同時將該生物樣本之MMP9表現量與一正常控制組樣本之MMP9表現量作比較，若該待測樣本之MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1表現量高於與該正常控制組之此三個基因之表現量時，且該生物樣本之MMP9表現量高於該正常控制組樣本之MMP9表現量，判定該待測者肝癌具轉移之風險。上述α-甘露糖苷酶四亞型(MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1及MAN1C1)或MMP9表現量可以是RNA或蛋白質表現量，且待測者係患有B型肝炎，該生物樣本係為該待測者之肝臟細胞。
    在另一實施例中，可發展作為一種抑制肝癌細胞轉移的方法，包括在一肝癌細胞中過度表現MAN1C1，以抑制該肝癌細胞之轉移。較佳地，過度表現MAN1C1亦可降低該肝癌細胞中MMP9表現量。
    在又一實施例中，亦可發展作為一種篩選肝癌治療藥物之方法，包括：(A)提供一藥物處理過後之肝癌細胞；(B)檢測該肝癌細胞中MAN1C1表現量；(C)依據其MAN1C1表現量判定該藥物是否有效。較佳地，前述方法更包括檢測該肝癌細胞中MMP9表現量，並根據其MMP9表現量判定該藥物是否有效。
    第1圖係顯示高爾基體N-linked糖化作用路徑；
    第2A-2B圖係顯示本發明之實驗流程圖；
    第3圖係顯示在人類帶有B型肝炎病毒的肝癌患者的肝癌組織中MANA1、MANA2，MANB1、MAN1C及MAN1C1表現量；
    第4圖係顯示利用定量聚合酶反應方式檢測不同細胞株中內生性的MAN1A1,MAN1A2,MAN1B1 RNA的量；
    第5A-5E圖係顯示大量表現MAN1A1和MAN1C1後的體外細胞遷移試驗結果；
    第6A-6E係顯示以shRNA抑制MAN1A1,MAN1A2和MAN1B1表現後的體外細胞遷移試驗結果；
    第7A-7C圖係顯示穩定大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(MAN1C1/Hep3B)後的體外細胞遷移試驗結果；
    第8A-8E圖係顯示藉由活體異體移植進行體內細胞遷移試驗測試293T,PLC5和Hep3B在活體中的細胞遷移能力之結果；
    第9A-9D圖係顯示穩定大量表現MAN1C1在Hep3B細胞(MAN1C1/Hep3B)後的活體異體移植細胞遷移試驗結果；
    第10圖係顯示細胞生長試驗(MTT assay)之結果；
    第11A-11B圖係顯示利用過度表現MAN1C1對於MMP9表現量之結果。
    权利要求:
    Claims (16)
    [1] 一種早期檢測肝癌之方法，其步驟包括：(A)　提供一待測者之生物樣本；(B)　檢測該生物樣本之α-甘露糖苷酶四亞型中MAN1C1基因表現量；(C)　將該生物樣本之MAN1C1基因表現量與一正常控制組樣本之MAN1C1表現量作比較；及(D)　根據比較結果判定該待測者是否具有罹患肝癌之風險；其中，該待測樣本之MAN1C1表現量低於與該正常控制組之MAN1C1表現量時，判定該待測者具有罹患肝癌之風險。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該待測樣本之MAN1C1表現量與該正常控制組之此四基因的表現量至少2倍以上的差異。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(D)更包括同時將該生物樣本之MMP9表現量與一正常控制組樣本之MMP9表現量作比較。
    [4] 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該生物樣本之MMP9表現量高於該正常控制組樣本之MMP9表現量，判定該待測者肝癌具轉移之風險。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該MAN1C1表現量係為MAN1C1的RNA或蛋白質表現量。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該MMP9表現量係為MMP9的RNA或蛋白質表現量。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該待測者係患有B型肝炎。
    [8] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生物樣本係為該待測者之一肝臟細胞。
    [9] 如申請專利範圍第1項所述之方法，更包括過度表現MAN1C1亦可降低該肝癌細胞中MMP9表現量。
    [10] 一種抑制肝癌細胞轉移的方法，包括在一肝癌細胞中過度表現MAN1C1，以抑制該肝癌細胞之轉移。
    [11] 一種檢測肝癌轉移之方法，其步驟包括：(A)　提供一待測者之生物樣本；(B)　檢測該生物樣本之α-甘露糖苷酶四亞型中MAN1A1、MAN1A2及MAN1B1基因表現量；(C)　將該生物樣本之MAN1A1、MAN1A2及MAN1B1基因表現量與正常控制組樣本之MAN1A1、MAN1A2及MAN1B1基因表現量作比較；(D)　根據比較結果判定該待測者是否具有肝癌轉移之風險；其中，若該待測樣本之MAN1A1、MAN1A2及MAN1B1基因表現量高於與該正常控制組之此三個基因之表現量時，判定該待測者具肝癌轉移之風險。
    [12] 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該待測樣本之MAN1A1、MAN1A2及MAN1B1基因表現量與該正常控制組之此三基因的表現量至少2倍以上的差異。
    [13] 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該MAN1A1、MAN1A2及MAN1B1基因表現量係為MAN1A1、MAN1A2及MAN1B1的RNA或蛋白質表現量。
    [14] 如申請專利範圍第11項所述之方法，該待測樣本更包含比較α-甘露糖苷酶四亞型MAN1C1；若MAN1A1、MAN1A2及MAN1B1表現量高於與該正常控制組之此三個基因之表現量時，且MAN1C1基因表現量低於該正常控制組之MAN1C1基因表現量時，判定該待測者已罹患肝癌且具轉移之風險。
    [15] 一種篩選肝癌治療藥物之方法，包括：(A)　提供一藥物處理過後之肝癌細胞；(B)　檢測該肝癌細胞中MAN1C1表現量；(C)　依據其MAN1C1表現量判定該藥物是否有效。
    [16] 如申請專利範圍第15項所述之方法，更包括檢測該肝癌細胞中MMP9表現量，並根據其MMP9表現量判定該該藥物是否有效。
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